Un estudio comparativo utilizando metodología de superficie de respuesta y red neuronal artificial para optimizar la producción de melanina por Aureobasidium pullulans AKW

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13545 (2023) Citar este artículo

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El efecto de tres variables independientes (es decir, tirosina, sacarosa y tiempo de incubación) sobre la producción de melanina por Aureobasidium pullulans AKW se desentrañó mediante dos enfoques distintivos: metodología de superficie de respuesta (es decir, diseño de Box Behnken (BBD)) y red neuronal artificial (ANN). en este estudio por primera vez utilizando un medio simple. Con respecto al BBD, la sacarosa y los intervalos de incubación impusieron una influencia significativa en la producción (niveles de melanina), sin embargo, la tirosina no. El proceso de validación mostró una alta consistencia de los paradigmas BBD y ANN con la producción experimental de melanina. En cuanto a ANN, los valores predichos de melanina fueron altamente comparables a los valores experimentales, con errores menores que competían con BBD. Se lograron valores experimentales de melanina altamente comparables al usar BBD (9,295 ± 0,556 g/L) y ANN (10,192 ± 0,782 g/L). ANN predijo con precisión la producción de melanina y mostró una mayor mejora en la producción de melanina en aproximadamente un 9,7% más que BBD. La estructura de la melanina purificada se verificó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX), patrón de difracción de rayos X (XRD) y análisis termogravimétrico (TGA). Los resultados verificaron la arquitectura jerárquica de las partículas como pequeñas brújulas mediante análisis SEM, el espaciamiento entre capas en el análisis XRD, el % atómico máximo para átomos de carbono y oxígeno en el análisis EDX, y la gran estabilidad térmica en el análisis TGA de las partículas. melanina purificada. Curiosamente, la nueva cepa endofítica actual era independiente de la tirosina, y el paradigma ANN aplicado de forma única fue más eficiente en modelar la producción de melanina con una cantidad apreciada en un medio simple en un tiempo relativamente corto (168 h), lo que sugiere estudios de optimización adicionales para una mayor maximización. de producción de melanina.

La curiosidad por los pigmentos naturales, especialmente los provenientes de microorganismos, ha atraído a los consumidores, ya que la difusión de los colorantes sintéticos en cosméticos, procesamiento de alimentos, textiles y productos farmacéuticos se volvió limitada, debido a su carcinogenicidad, hiperalergenicidad y toxigenicidad1,2. El valor de los pigmentos microbianos incluye su alta estabilidad, rendimiento y fácil producción, así como su bajo costo y facilidad de cultivo microbiano3. La producción microbiana de melanina es un campo de investigación talentoso, debido al crecimiento de la industria que exige pigmentos naturales como productos seguros, fácilmente degradables y ecológicos1.

La melanina es un pigmento de color marrón oscuro que se forma por la polimerización oxidativa de compuestos fenólicos, como el glutaminil-3,4-dihidroxibenceno, el catecol, el 3,4-dihidroxinaftaleno o la 3,4-dihidroxi-fenilalanina, durante las vías metabólicas del En hongos, otra ruta es la de la 3,4-dihidroxifenilalanina, donde la tirosina es catalizada por la tirosinasa y lacasa para formar dopaquinona, que se oxida y se autopolimeriza a melanina3,4. Además, la producción de melanina depende de las enzimas tirosinasa intra y/o extracelulares, por lo que varios estudios lograron el proceso cinético de activación, inactivación, inductor e inhibidores de la enzima tirosinasa durante el crecimiento de Penicillium chrysogenium, Trichderma reesei y Trichoderma harzianum2,5.

Entre los productores microbianos de melanina, los hongos tienen una superioridad en la construcción de melanina con disponibilidad como fuente potente, porque son competentes en producir un alto rendimiento de la sustancia en el medio de cultivo de bajo costo, lo que hace que el bioproceso sea económicamente viable a escala industrial. ,4. Se informó que varios hongos ascomicetos producen melanina, por ejemplo, Aureobasidium pullulans, Neophaeotheca triangularis, Trimmatostroma salinum y Hortaea werneckii6,7. En comparación con las bacterias, estos hongos tienen ventajas potenciales debido al predominio de dos enzimas clave (tirosinasa y lacasa) que desempeñan un papel importante en la producción de melanina8.

Hubo que investigar y explorar otra área virgen de microorganismos para la producción de melanina, es decir, los microbios endofíticos, que son más eficientes en la producción de biomoléculas únicas en cantidades apreciadas. Los endófitos se refieren a comunidades microbianas que viven y crecen dentro de los tejidos vegetales sin causar ningún daño al huésped9.

La melanina tiene varias aplicaciones posibles en el campo medicinal, por ejemplo, antimicrobiana, antiviral, antioxidante, antitumoral y antiinflamatoria, así como en cosméticos como agente protector para la piel y los ojos3,10, y en la biorremediación ambiental de sitios contaminados por agentes pesados. metales11. Debido a estos beneficios de la melanina en una variedad de aplicaciones, existe una demanda creciente de producción de melanina en un medio de bajo costo. El proceso de bioproducción podría reducirse sustancialmente utilizando un nuevo concepto de optimización12.

La metodología de superficie de respuesta (RSM) es un diseño estadístico multivariado aplicado para evaluar los efectos de factores, construir modelos y predecir condiciones óptimas con el número mínimo de ejecuciones9,13,14. RSM es una técnica estadística que modela la correlación entre múltiples variables independientes y la respuesta del bioproceso. Se aplica comúnmente para optimizar el rendimiento de los bioprocesos mediante la identificación de la configuración óptima para un conjunto de variables que influyen en la respuesta. RSM es una forma eficiente de diseñar y analizar experimentos para optimizar el rendimiento de los bioprocesos. Esto, a su vez, permite determinar un punto fuerte donde los parámetros pueden lograr el mayor rendimiento y los menores parámetros de operación y error posibles9,13.

Los diseños compuestos centrales (CCD) y BBD son RSM que se pueden utilizar para ajustar un modelo cuadrático completo. Se seleccionó BBD porque no incluye puntos axiales que están ubicados fuera del cubo del espacio de diseño para estimar la curvatura de la superficie de respuesta; por lo tanto, BBD tiene menos puntos de diseño y ahorra tiempo y dinero, en comparación con CCD. Estos puntos no son necesarios si la región de interés se comporta bien, como es el caso en nuestro estudio aquí. Por la misma razón, es seguro ejecutar BBD, porque no hay carreras extremas y los factores funcionaron bien en los límites probados. Debido a la naturaleza giratoria del BBD, es más robusto al ruido, lo que significa que no es sensible al orden de las ejecuciones experimentales, es decir, no necesita ejecutar el diseño en un orden específico15,16,17.

BBD implica variar las variables de entrada (factores) dentro de ciertos rangos y niveles predeterminados, lo que permite un uso eficiente de los recursos y una reducción de las ejecuciones experimentales18. El diseño también puede ser útil para estudiar las interacciones entre variables e identificar la combinación óptima de variables que maximiza la variable respuesta19. La revisión de la literatura contiene una gran cantidad de informes que destacan el potencial de RSM, en particular, el BBD, en la optimización de numerosos bioproductos como enzimas (α-amilasa15, β-xilanasa20, producción de oligosacáridos pécticos21, biodegradación de antibióticos en el medio ambiente17 y producción de pigmentos monascus16, etc.

No se ha realizado ningún trabajo previo sobre la optimización de la producción de melanina mediante inteligencia artificial. La red neuronal artificial (ANN) sirve como elemento central y una de las herramientas básicas utilizadas en el aprendizaje automático. ANN podría considerarse una extensión avanzada de RSM y podría magníficamente sustituir el enfoque de modelado basado en regresión polinomial de RSM22,23,24. Al igual que el cerebro humano, una ANN es capaz de analizar y procesar datos de manera sofisticada mediante la construcción eficiente de modelos computacionales con nodos completamente conectados dentro de las capas ocultas. Este tipo de modelado facilita el aprendizaje de patrones de datos y, como resultado, permite una toma de decisiones precisa basada en datos históricos. Al construir un modelo ANN, primero se selecciona la arquitectura de la red, seguido de la creación de capas ocultas con suficientes neuronas. Luego, la red pasa por un proceso de aprendizaje y capacitación hasta que capta el patrón de datos. Una vez completado, el modelo ANN resultante se valida y verifica antes de aprobarlo como modelo predictivo. El paradigma de ANN se basa en identificar varios patrones en los datos y detectar cualquier diferencia para determinar el patrón que logra el resultado deseado. Este proceso se regula mediante retropropagación inteligente, que genera el modelo de salida deseado para lograr el objetivo (objetivo). Este procedimiento es más preciso y puede sustituir eficazmente otros métodos de modelización22,25.

En este estudio nuestro objetivo fue desarrollar un medio simple que contenga los requisitos mínimos para la producción de melanina (es decir, tirosina y sacarosa, además del período de incubación). La razón detrás de la selección de tirosina es que la biosíntesis de melanina depende de la tirosina como precursora para la producción de melanina3. Muchas fuentes de carbono podrían ser metabolizadas por hongos, pero no hay datos documentados que indiquen el papel de la sacarosa o las fuentes de carbono en la síntesis de melanina por parte de los hongos, pero la mayoría de los hongos pueden participar en diversos procesos metabólicos para obtener energía y crecimiento26. Aquí se seleccionó la sacarosa como una fuente de carbono barata y fácilmente disponible. El tiempo de fermentación es crucial para la producción de melanina, ya que determina la duración y el alcance de la síntesis de melanina.

Sin embargo, aunque la producción comercial de melanina de origen microbiano ha experimentado avances significativos27, todavía hay margen de mejora. Por lo tanto, nuestro estudio tuvo como objetivo optimizar la producción de melanina utilizando una combinación de metodologías BBD y ANN. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que utiliza el procedimiento ANN para mejorar la producción de melanina del hongo endofítico A. pullulans, mientras utiliza una fuente de medio económico.

La cepa AKW de Aureobasidium pullulans fue aislada e identificada en nuestro estudio anterior28. El cultivo madre se conservó en placas de agar patata dextrosa después de incubarlo a 30 °C durante 5 días en condiciones de oscuridad y se subcultivó periódicamente. Para la preparación del inóculo estándar, se cultivó A. pullulans AKW en el mismo medio de fermentación con agitación (100 rpm, 30 °C, 72 h) para obtener un recuento celular de aproximadamente 3 × 107 células/ml.

Para el proceso de producción de melanina, se utilizó un medio de fermentación simple, es decir, caldo de sacarosa de patata. El medio se preparó utilizando infusión de papa como base para el medio de fermentación. Para preparar la infusión de papa, se hirvieron 200 g de papas cortadas en rodajas y sin pelar en un litro de agua destilada durante 30 minutos, luego se filtraron para eliminar los restos de residuos de papa. A la infusión de papa se le agregaron diferentes concentraciones de tirosina (como inductor de la producción de melanina) y sacarosa (como fuente de carbono) (Tabla 1). El pH del medio se ajustó a 6,0. Se transfirieron porciones de 100 ml de medio a matraces canónicos y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. El medio fue inoculado con inóculo fúngico en una proporción del 5%. El medio de cultivo inoculado se incubó a 30 °C por diferentes períodos con una velocidad de rotación de 200 rpm.

Se utilizó el protocolo de El-Gamal et al.29 y Müjdeci30 para la separación y purificación de melanina con modificaciones menores. Brevemente, la melanina se separó de los sedimentos de células microbianas mediante centrifugación durante 15 minutos a 3000 xg. El filtrado libre de células resultante que contenía melanina se precipitó reduciendo el pH a 2,0 con HCl (6 M) y se mantuvo durante 4 h en refrigeración. El precipitado se centrifugó a 7000 xg durante 15 min. La melanina precipitada se lavó con agua destilada. El proceso se repitió cuatro veces para obtener melanina purificada. El pigmento purificado se almacenó (a -20 °C) después de la liofilización.

Esta investigación tuvo como objetivo estudiar la mejor combinación de los factores más importantes que afectan la producción de melanina en un medio simple. El estudio plantea la hipótesis de que la tirosina (el precursor de la producción de melanina), la sacarosa (la fuente de carbono más común) y el tiempo de incubación son factores importantes. Las tres variables independientes se optimizaron para maximizar la producción de melanina utilizando el BBD de RSM31. Con base en la matriz de BBD, los factores independientes se probaron en tres niveles (bajo, medio o alto). En consecuencia, se generaron 15 corridas que contienen tres puntos centrales (niveles medios). La Tabla 1 muestra la matriz de diseño experimental, que incluye las diversas combinaciones de las tres variables. Cada combinación se repitió tres veces. Al realizar las pruebas experimentales como se indicó anteriormente, se midió la producción de melanina como la respuesta objetivo a la matriz de tres factores. Luego, los datos recopilados se analizaron estadísticamente para descubrir la relación entre las tres variables independientes y la producción de melanina para predecir el nivel óptimo de cada factor, la siguiente ecuación. (1) se aplicó:

donde Y es la producción de melanina prevista, β0 es la constante del modelo, βi es el coeficiente lineal, βij es el coeficiente del producto cruzado, βii es el coeficiente cuadrático y Xi y Xj son las variables independientes.

La ecuación se utilizó para descubrir la conexión entre las variables independientes y la producción de melanina, así como para predecir la concentración óptima de cada factor. Se realizaron análisis de varianza (ANOVA) y coeficiente de determinación (R2) para determinar la significancia de las variables y asegurar la bondad del modelo. Además, la precisión de BBD se evaluó visualmente trazando los valores previstos frente a los valores reales y examinando la distribución de los puntos de datos.

Los datos obtenidos de la matriz BBD se utilizaron para desarrollar un modelo predictivo con aprendizaje automático. El modelo de ANN se creó entrenando una ANN completamente conectada con dos capas ocultas, en la que todos los nodos estaban equipados con un sigmoide tangente hiperbólico; Función de activación exp(-x2). El modelo de pronóstico establecido fue un algoritmo totalmente conectado de perceptrón multicapa.

En consecuencia, los datos se dividieron en (i) el conjunto de entrenamiento que se usó para reducir el error y establecer pesos en cada neurona de la ANN, (ii) el conjunto de validación que se usó para ajustar los hiperparámetros y monitorear el rendimiento del modelo durante el entrenamiento para detener el entrenamiento de ANN y seleccionar el mejor modelo, y finalmente (iii) el conjunto de pruebas que se usó para evaluar el modelo entrenado final, como un conjunto de datos externo que se usó únicamente para probar la robustez de ANN y servir como valoración final de las capacidades de predicción; Este conjunto de datos externos no se utilizó durante el proceso de desarrollo del modelo32.

La topología de ANN se investigó utilizando varias capas y nodos ocultos. La topología de la RNA se designó como 3-h-1. Tres neuronas de los factores probados (es decir, tirosina, sacarosa y tiempo de incubación) representan la capa de entrada. La capa de salida está compuesta por una neurona (producción de melanina fúngica). Se crearon capas ocultas adicionales entre las dos capas de entrada y salida, en las que se probó un rango de neuronas de 3 a 10.

ANN se entrenó mediante prueba y error en varios parámetros específicos (tasa de aprendizaje, método de aprendizaje y número ideal de neuronas en la capa oculta). Para cada fase de prueba, se utilizó un recorrido de 10.000 personas. Luego, se identificó la estructura arquitectónica óptima que se ajusta al mejor modelo. Se empleó el proceso de prueba y error hasta que el error más bajo fue para la raíz del error cuadrático promedio (RASE) y el error absoluto promedio (AAE). El coeficiente de variación (R2) entre los valores previstos y reales también se utilizó para evaluar el proceso de entrenamiento.

La precisión de la ANN entrenada se determinó comparando sus resultados previstos con los valores reales de producción de melanina. Si los valores predichos eran cercanos o equivalentes a los valores reales, entonces se consideraba que la RNA tenía alta precisión en sus predicciones. Esta evaluación generalmente se realizaba calculando una medida estadística de precisión, RASE, AAE y R2. Además, la precisión de la ANN se evaluó visualmente trazando los valores predichos frente a los valores reales y examinando la distribución de los puntos de datos24.

El nivel óptimo de cada uno de los factores probados que maximizan la producción de melanina se estimó teóricamente utilizando el modelo ajustado de BBD y ANN, luego se estimó la producción de melanina esperada. Se realizó una prueba de verificación, aplicando la configuración óptima en el laboratorio por triplicado y comparándola con los valores de melanina previstos para probar la precisión de ambos modelos.

Los datos de producción de melanina se presentaron como media ± desviación estándar. El diseño de la matriz BBD y el análisis estadístico se realizaron utilizando el software JMP® Pro 17 (JMP®, SAS Institute Inc., Cary, NC). El software también se utilizó para realizar procedimientos de aprendizaje automático, construir la topología de ANN e implementar los procedimientos de capacitación, validación y prueba.

La morfología de la superficie de las partículas del pigmento de melanina purificada se inspeccionó mediante un microscopio electrónico de barrido (SEM)33. La melanina recubierta de oro, previamente liofilizada, se examinó mediante SEM tipo FEI Czech (voltaje de aceleración a 25 kV), que consta de una columna óptica de electrones, un sistema de vacío y una electrónica. Las lentes electromagnéticas enfocaron los electrones en un fino punto sobre la melanina. El cañón de electrones, el filamento de tungsteno en la parte superior de la columna, produjo el haz de electrones, que se enfoca en un punto fino de menos de 4 nm de diámetro en la muestra de melanina. Este haz se escanea en lonchas rectangulares. El patrón de composición se determinó mediante espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX)33, que está conectada a SEM.

El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en Perkin Elmer 400033. El análisis del patrón de difracción de rayos X (DRX) se realizó en Pan Analytical Philips según Khouqeer et al.34. Se aplicó la ecuación de Bragg (Ec. 2) para calcular el espaciado entre capas d. El tamaño medio de grano (cristalino) de la melanina se estimó mediante la ecuación de Dedye-Schrerrer (Ec. 3). El porcentaje de cristalinidad de melanina se calculó correspondientemente como se indica en (Ec. 4), considerando el sustrato de vidrio como fondo.

donde, θ ≡ ángulo de difracción; m ≡ orden de difracción; λ ≡ longitud de onda de rayos X en la difracción de primer orden considerada (m = 1).

donde, λ denota la longitud de onda (1.54) y FWHM ≡ ancho total en la mitad del máximo de un pico de difracción.

Se optimizó secuencialmente un medio simple del hongo parecido a la levadura, A. pullulans AKW, para la producción de melanina mediante los paradigmas BBD y ANN. La melanina resultante se caracterizó según las propiedades SEM, XRD, EDX y TGA.

Los datos de la Tabla 1 muestran el patrón de una matriz de diseño de 15 ejecuciones de las diferentes combinaciones de las tres variables junto con la producción experimental de melanina. Los datos obtenidos revelaron una variación sustancial en la producción de melanina con la mejor combinación de niveles en el punto central (nivel medio), siendo 5,69 ± 0,39 (ensayo número 14).

La importancia relativa única, de interacción y cuadrática de los factores probados se cuantificaron utilizando el valor P para comparación. El peso estadístico (Fig. 1) de las variables probadas se utilizó para detectar qué predictor (variable) es el más significativo. La variable más importante tiene el valor P más bajo. Asimismo, el efecto único del tiempo de incubación y la sacarosa fue significativo, mientras que el nivel de tirosina no mostró ninguna influencia significativa sobre la producción de melanina. En cuanto al efecto de interacción, la interacción de la tirosina con los otros dos factores (tiempo de incubación y nivel de sacarosa) mostró un efecto no significativo. Finalmente, las tres variables mostraron un efecto cuadrático significativo.

La importancia relativa única, de interacción y cuadrática de los factores probados en la producción de melanina por A. pullulans AKW.

Los datos de BBD fueron analizados mediante ANOVA (Tabla 2). El modelo general es significativo (valor F = 42,4805) con un valor P muy bajo (0,0003); por otro lado, la falta de error de ajuste no es estadísticamente significativo (valor P = 0,9206). Se estimaron adicionalmente otras estadísticas de evaluación del modelo, es decir, los valores R2, R2 ajustado y R2 orgulloso, que resultaron ser extremadamente altos, siendo 0,9871, 0,9639 y 0,9382, respectivamente.

ANOVA también investigó los términos simples, de interacción y cuadráticos. Aparte de la tirosina, la sacarosa y el tiempo de incubación fueron significativos. En cuanto a la interacción entre variables, la interacción entre el nivel de sacarosa y el tiempo de incubación tiene un efecto significativo (valor P = 0,0073). De lo contrario, todos los términos cuadráticos mostraron un efecto significativo (valor P ≤ 0,05) sobre la producción de melanina mediada por A. pullulans AKW.

En consecuencia, los coeficientes de regresión de los distintos términos del modelo fueron calculados y obedecidos a una función polinómica de segundo orden. La producción de melanina prevista por A. pullulans AKW se estimó mediante la siguiente ecuación:

donde Y es la producción de melanina prevista, X1 es tirosina (%, p/v), X2; es sacarosa (%, p/v), y X3 es el tiempo de incubación (h).

Como se pudo observar, algunos términos del modelo (X1, X3, X1X3 y todos los términos cuadráticos) mostraron valores de coeficientes negativos, mientras que otros tuvieron valores de coeficientes positivos. Sin embargo, se utilizó una ecuación de este tipo para la predicción de los valores de producción de melanina, que resultaron ser muy cercanos a los experimentales y, por lo tanto, tenían errores más bajos. Con base en el modelo de regresión anterior, los valores predichos por BBD se estimaron y compararon con los valores reales. Tanto los valores estimados como los reales en cada punto de datos mostraron una alta concordancia (Tabla 2).

Se empleó un diseño de ANN de avance multicapa en una plataforma de red neuronal que está completamente conectada para construir un modelo de ANN predictivo. Durante el procedimiento de prueba y error, se utilizó la relación de propagación de retención en 0,3333, lo que dividió los datos de BBD en dos conjuntos, el primer conjunto tenía 10 ejecuciones para el entrenamiento para reducir el error de predicción y crear pesos neuronales. El segundo conjunto se compone de 5 ejecuciones de validación para detener el entrenamiento de ANN y elegir el mejor modelo. Después de varias pruebas (cada una de 10.000 giras) con varios arreglos de ANN. La penalización de la topología ANN se logró mejor con una tasa de aprendizaje al cuadrado de 0,2, con dos capas ocultas, cada una con 4 nodos. La función de activación en todos los nodos de ambas capas ocultas de la red fue la tangente sigmoidea hiperbólica (NTanH). Como resultado, se determinó que la arquitectura óptima era una estructura topológica de ANN de cuatro capas (Fig. 2), denominada 3–4–4–1. La capa de entrada consta de tres neuronas (factores independientes), que son tirosina, sacarosa y tiempo de incubación. La capa de salida de neuronas representa el factor de respuesta de la producción de melanina. Las dos capas ocultas demostraron un rendimiento superior al emplear la función de activación de NTanH(4)NTanH2(4) en las neuronas ocultas.

El diseño de ANN de la producción de melanina por A. pullulans AKW. La ANN contiene una capa de entrada (tres neuronas), dos capas ocultas (4 neuronas cada una) y la capa de salida (una neurona).

Para probar la generalidad del modelo, se realizaron pruebas para minimizar los errores durante el proceso de aprendizaje automático. La RNA fue entrenada hasta maximizar el valor R2, logrando una puntuación de 0,9857 para entrenamiento y 0,9935 para validación.

Se evaluó la capacidad de la red entrenada para predecir con precisión los resultados. Los valores previstos para cada punto de los datos de BBD se calcularon utilizando la ANN (Tabla 1). Los valores predichos por ANN mostraron una alta coherencia con los valores de la investigación y mostraron valores de error más bajos que los del modelo BBD.

Se realizó un análisis residual para una evaluación adicional de ambos modelos para predecir la producción de melanina por A. pullulans AKW. Los residuos trazados versus los valores predichos por ambos modelos (Fig. 3) revelaron una distribución igual de los puntos residuales que estaban dispersos estrechamente e igualmente alrededor del eje 0 sin mostrar linealidad.

Gráficos de BBD y ANN, que muestran los valores previstos de producción de melanina versus datos residuales y reales.

También se investigaron los puntos del modelo predicho en comparación con los valores experimentales reales de ambos modelos (Fig. 3). Los puntos de ambos modelos se encuentran cerca de la línea de predicción perfecta, lo que implica que el modelo puede aproximarse fielmente a los datos experimentales reales. Sin embargo, la regresión lineal mostró que las predicciones del modelo ANN están significativamente más cerca de la línea de predicción en comparación con el modelo BBD.

Para conocer los efectos mutuos e interactivos entre cada par de variables, se construyeron los gráficos 3D de BBD y ANN (Fig. 4). Los gráficos 3D representaron las relaciones entre las variables, lo que demuestra un aumento en la producción de melanina a medida que la concentración de las tres variables (es decir, tirosina, sacarosa y tiempo de incubación) se acercó al nivel óptimo. Sin embargo, una vez superado el nivel óptimo, se observó una disminución en la producción de melanina. Se puede observar que niveles más altos de las tres variables tienen un efecto negativo en la respuesta.

Gráficos tridimensionales de superficie de respuesta de la producción de melanina por A. pullulans AKW, representados como una combinación por pares de los factores probados, manteniendo el tercer factor constante en su nivel central (medio), según los modelos de BBD (representado por la derecha). columna) y ANN (representada por la columna de la izquierda).

En comparación con BBD, ANN demuestra una curva elíptica del gráfico de superficie de respuesta entre cada par de factores probados. Los gráficos 3D de BBD mostraron varios patrones, y no se pudo dibujar ningún prototipo específico para cada par de factores probados, donde la curva elíptica apareció solo en la interacción entre los niveles de tirosina y sacarosa. En general, el gráfico 3D indica que el proceso de producción de melanina alcanzó su valor máximo alrededor de los puntos centrales del diseño experimental.

Tanto el modelo BBD como el ANN exhibieron una gran capacidad predictiva y residuos más bajos, lo que indica que pueden ajustarse con precisión a datos de investigación reales y realizar predicciones altamente confiables. Para evaluar la precisión de estos modelos en la predicción de la producción de melanina, se evaluaron varios parámetros estadísticos durante los procesos de entrenamiento y validación, así como para los modelos generales (Tabla 3). Según las estadísticas de rendimiento, el modelo ANN tenía más confianza que el modelo BBD, donde el valor R2 del modelo ANN general era mayor que el del modelo BBD. Por otro lado, los valores de RASE y AAE registraron valores más bajos para el modelo ANN que para el modelo BBD.

Se realizó un experimento de verificación basado en los valores predichos de cada factor por ambos modelos, para evaluar el proceso de modelado utilizado en el estudio de optimización de la producción de melanina. Las condiciones óptimas previstas se calcularon por separado mediante los modelos BBD y ANN (Tabla 3). Luego se validaron experimentalmente los valores calculados de los tres factores probados. Bajo las condiciones teóricas óptimas para las tres variables, la respuesta de la producción de melanina se calculó en 10,555 y 10,286 g/L para BBD y ANN, respectivamente. El proceso de validación reveló una alta consistencia con la producción experimental de melanina, siendo 9,295 ± 0,556 g/L (BBD) y 10,192 ± 0,782 g/L (ANN). Vale la pena mencionar que ambos modelos mostraron una alta precisión, pero ANN superó al modelo BBD en la predicción de la producción de melanina, logrando un aumento del 9,7% en la producción de melanina con respecto al BBD.

Siguiendo las condiciones anteriores, se llevó a cabo una producción masiva de melanina y posteriormente se aisló para la investigación de la estructura química. La melanina obtenida presenta un aspecto granular negro (Fig. 5). Generalmente, la melanina es un heteropolímero que consta de diversas subunidades, lo que da como resultado una estructura molecular compleja, amorfa e insoluble. Sin embargo, la composición específica de la melanina varía según su fuente. Por lo tanto, los métodos tradicionales enfrentan desafíos al intentar examinar su constitución. En consecuencia, los investigadores emplean varios métodos para explorar la estructura de la melanina.

Una visión de cerca de las partículas de melanina biosintetizadas por A. pullulans AKW.

Se aplicó el análisis SEM para investigar las características morfológicas y la arquitectura de la melanina. El análisis proporcionó una topografía con imágenes de gran aumento de la superficie de las partículas de melanina (Fig. 6). SEM investigó la arquitectura jerárquica de las partículas de melanina producidas por A. pullulans AKW. Generalmente, las partículas de polímero de melanina se mostraban en pequeños compases y agregadas.

Micrografías SEM de partículas de pigmento de melanina producidas por A. pullulans AKW a los diferentes aumentos indicados.

El pigmento de melanina preparado se analizó mediante análisis XRD para investigar su tipo de material, fase, propiedades cristalográficas, composición química y características físicas. El análisis depende de la interferencia constructiva entre la melanina cristalina y los rayos X monocromáticos. El gráfico del análisis XRD se muestra en la Fig. 7 y los datos se presentan en la Tabla 4.

El análisis XRD de la melanina.

El análisis EDX como técnica analítica se implementó para el pigmento de melanina como se muestra en la Fig. 8. El análisis EDX se aplicó para estimar el análisis elemental y la composición química del pigmento de melanina purificado.

El análisis EDX del pigmento de melanina purificado.

Se aplicó TGA para investigar las propiedades térmicas del pigmento de melanina purificado. Por lo tanto, los resultados que se muestran en la Fig. 9 demostraron la pérdida inicial de masa con un pico a 191,55 °C con indicación de que no hay agua adsorbida residual.

Análisis termogravimétrico de melanina.

El proceso de fermentación microbiana para optimizar la producción de melanina es un procedimiento auspicioso ya que la melanina microbiana es ecológica, biocompatible y económica. Además, el polímero de melanina tiene un amplio espectro de aplicaciones, como molécula bioactiva (antioxidante, protector solar y agente antimicrobiano), y también podría usarse en biomateriales funcionales como sensibilizador en células solares sensibilizadas por colorantes y polímero marco para nanopartículas metálicas. así como en la biorremediación de sitios contaminantes metálicos y materiales electrónicos extracelulares en celdas de combustible microbianas3,35. Por lo tanto, el presente estudio se ha organizado para maximizar la producción de melanina por parte del endofítico; A. pullulans AKW, utilizando BBD, mientras que el paradigma ANN se aplicó por primera vez.

Con respecto al paradigma BBD, los puntos centrales (medios) de los factores probados lograron la producción máxima de melanina, siendo 10,811 ± 0,539 g/L (ensayo 14). Estos resultados indican que el nivel seleccionado de cada factor fue lo suficientemente preciso. Como lo demuestran los valores F altos y los valores P bajos en ANOVA, la mayoría de los términos del modelo demostraron un efecto significativo y una falta de error significativo del modelo en comparación con el error puro, lo que confirma la precisión de los datos obtenidos y el diseño experimental. Otra, cuando el modelo tiene un valor F alto y una falta de ajuste no significativa, es indicativo de aptitud adecuada. A diferencia de la tirosina, el tiempo de incubación y el nivel de sacarosa alcanzan una tendencia significativa.

Comúnmente, el valor P se emplea para detectar la importancia de los coeficientes de varios términos del modelo. El nivel de significancia en el umbral alfa ≤ 0,05 significa la incidencia de una fuerte asociación entre las variables analizadas y la respuesta (producción de melanina)25.

La prueba F plantea la hipótesis de que no hay variaciones (hipótesis nula, H0) entre los términos del modelo en la respuesta. En cambio, H0 rechazada indica que los términos del modelo varían entre sí (hipótesis alternativa, H1). Un valor P grande (> 0,05) proporciona pruebas sólidas para aceptar H0,13,36. Con base en ANOVA, se rechazó la H0, lo que significa la importancia de los factores probados y la confiabilidad del modelo para predecir la producción de melanina por A. pullulans AKW dentro del espacio investigado.

Además, para que el modelo sea confiable, R2, R2 ajustado y R2 orgulloso deben ser ≥ 0,75 y estar relativamente cerca uno del otro36. El R2 alto (0,9871), el R2 ajustado (0,9639) y el R2 orgulloso (0,9382) implican un buen modelo de regresión; además, la relación entre las tres variables probadas y la producción de melanina es estrecha. Un R2 predicho mucho más bajo que el R2 es una señal de advertencia de que el modelo está sobreajustando los datos; esto no se aplica a nuestro caso, donde están muy cerca uno del otro25.

Con base en los coeficientes estimados, se predijo el nivel óptimo de las tres variables y la respuesta de melanina, que era muy cercana a la producción real de melanina, lo que sugiere evidencia adicional de la precisión del modelo y también del espacio de diseño. El valor del coeficiente negativo indica una relación antagónica entre la producción de melanina y la concentración variable en el espacio de diseño probado, y viceversa. Sin embargo, varios estudios informaron que el BBD interviene en la identificación de los factores confiables para la maximización de la melanina, por ejemplo, la optimización de la composición del medio mejoró la producción de melanina por Aspergillus fumigatus12.

La estructura de topología óptima de ANN se denominó 3–4–4–1, que consta de tres neuronas de entrada, una neurona de salida y dos capas ocultas de 4 neuronas cada una, empleando la función de activación de NTanH(4)NTanH2(4).

Aunque la inteligencia artificial se ha vuelto cada vez más frecuente en las investigaciones científicas recientes, no ha habido ningún trabajo previo sobre la modulación de la producción microbiana de melanina utilizando ANN. Este estudio apoya este tipo de modelado.

El paradigma ANN es elástico, capaz de predecir bien y capaz de aprender cualquier función no lineal. Por tanto, ANN puede generar un modelo eficiente a partir de cualquier tipo de datos. La plataforma ANN utiliza un algoritmo de aprendizaje automático junto con una función flexible para las variables de entrada para construir un perceptrón multicapa completamente conectado. Esta arquitectura utiliza capas intermedias indirectas para predecir la producción de melanina objetivo por parte de A. pullulans AKW. Este enfoque de modelado es más adecuado cuando no es necesario dilucidar la correlación entre la respuesta y las entradas22,23,24.

La comparación de los valores residuales vis predichos de los modelos BBD y ANN mostró una distribución uniforme a lo largo de los lados del eje 0. Se observó un grupo apretado de puntos alrededor de la línea diagonal. Este patrón de distribución confirma la alta precisión y adecuación de ambos modelos. Además, los residuos y el análisis de regresión lineal de la ANN declararon que tanto los puntos predichos como los reales estaban ubicados muy cerca de la línea de predicción ideal que los del modelo BBD, designando un modelo de ANN bien entrenado, con mejor generalidad y mayor precisión. .

La curva de forma ovalada del gráfico 3D tanto para BBD como para ANN indica una interacción fuerte y clara entre cada par de factores probados, lo que sugiere una elección cuidadosa de los factores, y el modelo se ajusta bien al diseño9.

Sin embargo, a diferencia de ANN, el prototipo de ANN no era idéntico a BBD porque ANN puede descubrir relaciones no lineales complejas entre las entradas (tirosina, sacarosa y período de incubación) y la producción de melanina. ANN puede identificar conexiones ocultas entre variables de entrada y salida, incluso cuando no parecen tener una correlación explícita. Esto se debe a las dos capas intermedias en ANN que gestionan una correlación única entre entradas y salidas, en lugar de encontrar una ruta directa como se observa en BBD. Por lo tanto, las RNA son un excelente pronosticador cuando las relaciones entre la salida y la entrada no son necesarias o no son identificables22,23,24,25.

El rendimiento de ambos modelos se evaluó midiendo RASE y AAE. ANN mostró valores más bajos para las mediciones de ambos errores. Aunque la variación entre las estadísticas de cada modelo fue pequeña, el modelo ANN tiene una mejor capacidad de generalización que BBD en la producción de melanina. La validación experimental de la respuesta teórica de la producción de melanina calculada por ambos modelos indica la validez de ambos modelos.

ANN puede predecir con alta precisión porque puede manejar la no linealidad del sistema mejor que otros modelos que solo necesitan un cálculo de un paso para acercarse al objetivo22,23. La comparación de modelos de ANN y BBD requiere cierta consideración de las diferencias entre estos dos enfoques. ANN es un tipo de modelo de aprendizaje automático que imita el comportamiento del cerebro humano, mientras que BBD es un enfoque estadístico utilizado para optimizar variables de respuesta basadas en diseños experimentales. Por lo tanto, para comparar modelos de ANN y BBD, es necesario definir claramente la precisión de la predicción, la interpretabilidad del modelo, la complejidad computacional o la facilidad de implementación. Los modelos ANN a menudo se consideran modelos de caja negra, mientras que los modelos BBD suelen ser más interpretables. Además, la técnica de modelado de RNA implica la construcción de una arquitectura de red, instituyendo las capas ocultas y los números de nodos en cada capa, entrenando y, por último, justificando y autenticando el modelo obtenido. Por lo tanto, el paradigma RNA es supuestamente más preciso porque abarca todos los puntos de datos de los experimentos22,23,24,25. Además, la robustez y el rendimiento de generalización de ANN, especialmente en los datos nuevos, son mejores que los del modelo BBD. De hecho, la robustez de las ANN ante el ruido o los valores atípicos superó a BBD22,23. Por tanto, la decisión sobre las condiciones óptimas para la producción de melanina se tomó basándose en el modelo ANN.

Sin embargo, las ANN tienen algunas limitaciones, como tomar más tiempo de cálculo para el entrenamiento y la predicción, debido a muchas iteraciones, y no mostrar la importancia e influencia de cada factor en el modelo, lo que dificulta eliminar o simplificar cualquier factor del modelo. modelo22,32.

Comúnmente, la regulación de la producción de melanina depende de ciertas enzimas, es decir, la tirosinasa con esencialidad de los residuos sulfhidrilo y lisilo en el sitio activo de la enzima5. En el medio nutricional se utilizan ampliamente otras condiciones nutricionales, por ejemplo glucosa, peptona y extracto de levadura. Además, numerosos estudios recientes tuvieron como objetivo aprovechar los residuos agrícolas para la productividad de la melanina, como el licor de maceración de maíz, el extracto de desechos de frutas y el salvado de trigo, para minimizar el costo, con un alto rendimiento de melanina37. Además, existen varios estudios que logran la optimización de la melanina fúngica, por ejemplo, Ribera et al.38 optimizaron la síntesis de melanina por Armillaria borealis con un rendimiento de 11,58 g/L en un medio que contiene glucosa, extracto de levadura y tirosina, durante 97 días. Otro estudio optimizó la síntesis de melanina por parte del hongo Aspergillus fumigatus (0,1 g/L) en un medio que contenía dextrosa y peptona sin tirosina después de 10 días12. La melanina optimizada ha sido reportada por Auricularia auricula (2,97 g/L), en un medio que contiene lactosa, extracto de levadura y tirosina después de 8 días39. Mientras que Gliocephalotrichum simplex produjo melanina a 6,6 g/L después de 6 días en un medio que contenía peptona y extracto de levadura40. Sin embargo, en la Tabla 5, la productividad de los organismos en estudios previos se calculó como g/día y se comparó con el rendimiento actual de melanina de A. pullulans AKW.

En comparación con estos estudios previos, basados en el paradigma ANN, nuestra cepa (A. pullulans AKW) produjo una cantidad apreciada de melanina (10,192 g/L) después de un período de incubación más corto (168 h) en un medio de infusión de patata simple, que contenía tirosina (0,329%) y sacarosa (4,870%). El potencial biotecnológico de la cepa actual en la producción de melanina puede atribuirse a su producción constitutiva por parte del hongo que surgió como hongo endofítico.

El microbioma endofítico, también conocido como endosimbionte, se refiere a una amplia gama de bacterias y/u hongos que viven y se desarrollan dentro o entre las células de todo tipo de plantas sin causar ningún daño a la planta huésped durante al menos una parte de su ciclo de vida. . Los endófitos son un área de interés de reciente aparición debido a sus características únicas9.

Como reveló BBD, el actual A. pullulans AKW es independiente de la tirosina para la producción de melanina. Según nuestros resultados, Pseudomonas stutzeri produjo melanina (6,7 g/l) dentro de las 10 h posteriores a la incubación sin suplementación con tirosina8. Por el contrario, Surwase et al.47 encontraron que la L-tirosina a 1,872 g/L mejoraba la producción de melanina por Brevundimonas sp SGJ, siendo de 6,811 g/L. Generalmente, las rutas metabólicas de la melanina dependen de la enzima tirosinasa, que es un biocatalizador dependiente de cobre involucrado en la hidroxilación ortoespecífica y posterior oxidación de monofenoles como la tirosina8, además de la enzima lacasa que cataliza la oxidación de una amplia gama de sustratos como la tirosina, incluidos los dihidroxifenoles y las quinonas48. Además, el mecanismo de la melanina podría conducirse a través de diferentes vías, dependiendo de la polimerización aleatoria de algunos componentes básicos, por ejemplo, metabolitos de L-tirosina de indol-5,6-quinona, ácido 5,6-dihidroxiindol carboxílico, 5,6- ácido dihidroxiquinona carboxílico, dopamina, homogentisato y algunos precursores fenólicos49.

En general, se sugieren dos vías para la producción de melanina microbiana, la primera es la vía DOPA, catalizada por tirosinasa y lacasa, en la que la tirosina se convierte en L-DOPA y luego en dopaquinona. Este último es extremadamente activo y se oxida y autopolimeriza espontáneamente para crear melanina3. En la segunda vía DHN, la malonil-CoA se genera endógenamente, luego es catalizada por policétido sintasas, la condensación descarboxilativa secuencial de cinco moléculas de malonil-CoA genera 1,3,6,8-tetrahidroxinaftaleno, que se somete a ciclos de reducción y deshidratación. reacción, generando 1,8-dihidroxinaftaleno (DHN), que finalmente polimerizó a DHN melanina3. Otra hipótesis para la síntesis de melanina en microorganismos sugirió la formación de moléculas aromáticas hidroxiladas, durante el metabolismo catabólico, por ejemplo, como el ácido homogentísico que se acumula debido a un desequilibrio o interrupción enzimática, este proceso genera otros tipos de melanina50. Sobre esta base, nuestros datos sugieren que la melanina actual de A. pullulans AKW se biosintetiza independientemente de la tirosina.

Ya se sabe que la estructura de la melanina es complicada, en la que tiene varias formas dependiendo de la vía de polimerización, los componentes básicos y las enzimas; la melanina se clasifica en varios grupos, que incluyen eumelanina, piomelanina, feomelanina, neuromelanina y alomelanina8. Por tanto, se aclararon las características actuales de la melanina.

El estudio SEM de la arquitectura de las partículas de melanina confirmó que las partículas se encuentran en pequeños compases y con una forma cristalina definida. En este caso, las partículas de melanina pigmentada extraídas con un tamaño medio se encuentran entre 150 y 160 nm. Comúnmente, las partículas gráficas de melanina mostraban tener una forma cristalina definida, además de las partículas mostradas en pequeños compases.

El espectro XRD de la muestra de melanina producida se caracteriza por un pico amplio, que frecuentemente se percibe en materiales amorfos y desordenados equilibrados en aproximadamente 23,1501. Los valores del pico de reflexión de Bragg 2θ se encontraron para siete picos de difracción en 10.0341, 10.6947, 11.7830, 23.1501, 23.4513, 31.5697 y 53.8896 consistentes con el ancho de la punta (°2Theta) 0.0945, 0.0708, 0.1181, 0.09 45, 0,2362, 0,0472 y 0,1152, respectivamente. Este pico se registra debido a la difracción de rayos X de capas planas paralelas.

Se aplicó la ecuación de Bragg para calcular el espaciado entre capas d. Los valores calculados de d se encontraron en 8,81557, 8,27246, 7,51074, 3,84216, 3,79350, 2,83406 y 1,69994 para la muestra de melanina. Estos hallazgos coinciden con el valor publicado en la literatura sobre el espacio entre capas en el modelo de melanina de hojas apiladas. La calidad de la melanina purificada estuvo indicada por la proximidad de los valores del tamaño de grano.

Además, el porcentaje de cristalinidad de la melanina se calculó considerando un sustrato de vidrio como fondo. La muestra de melanina registró los porcentajes de intensidad relativa en 52,27, 66,76, 35,09, 100,0, 54,02, 61,82 y 33,66% para los siete picos de difracción, respectivamente. Estos hallazgos, respecto a la falta de patrones de difracción relacionados con la cristalinidad de la muestra, concuerdan con los resultados reportados por Tarangini y Mishra43, y Xin et al.51. La falta de cristalinidad se refería a las características físicas fiables de la melanina52.

El análisis EDX depende particularmente de la interacción de la excitación de rayos X con la muestra analizada. Los resultados indicaron los elementos más amplios con composiciones superlativas para los átomos de carbono y oxígeno con un peso de 54,38 y 33,27%, y un porcentaje atómico de 65,40 y 30,04%, respectivamente. Nuestros hallazgos están en perfecta conformidad en todos los aspectos con los resultados informados por Tarangini y Mishra53. Los datos también especificaron elementos menores en el análisis con un % atómico total de 4,55%, esto verificó la pureza de la melanina producida. Los elementos menores cuantificados se infirieron como sodio/K (0,18%), magnesio/K (0,12%), silicio/K (0,36%), azufre/K (0,30%), cloro/K (1,85%), potasio/K. (0,53%), calcio/K (0,15%) y hierro/K (1,06%). La variación en la composición de la melanina está respaldada por el factor del cambio en la composición del medio. Ribera et al.38 han supuesto que elementos poco frecuentes como el sodio, el potasio y el azufre están interrelacionados con la composición del medio de crecimiento. Además, un importante indicador preliminar de la pureza de la muestra es el mayor porcentaje de carbono, además de la presencia de peptona residual en la melanina cruda.

Asimismo, la pérdida de masa a 191,55 °C en el análisis TGA se refirió a la descomposición de la peptona junto a otros medios de crecimiento residuales. Según los informes bibliográficos54, las cadenas o componentes alifáticos se descomponían por debajo de 400 °C, pero los componentes aromáticos comenzaron a descomponerse por encima de 400 °C. Con respecto a nuestra muestra de melanina, la primera descomposición se produjo con una tasa de pérdida de peso inducida del 33% a 191,55 °C. Los resultados en todas las características indicaron una estabilidad térmica respetable de la melanina con una tasa de pérdida de peso inferior al 20% por unidad de 800 °C. Estos resultados sobre la resistencia intensiva de la melanina a la degradación térmica están en armonía con la literatura anterior55. Cabe mencionar que la melanina cruda se descompuso con pérdida de peso a 325 °C registrando la mayor pérdida de masa, mientras que la melanina se descompuso a 350 °C, estos hallazgos fueron reportados anteriormente por Ribera et al.38 y aprobados con nuestros resultados. En consecuencia, la segunda pérdida de masa se registró a 301,32 °C con una pérdida de masa inferior al 80%, y la tercera pérdida de masa se registró a 440,65 °C sin pérdida de masa significativa. En consecuencia, la cantidad de masa residual de la muestra sólida de melanina no mostró una variación sustancial (78%).

En resumen, el proceso de optimización de la melanina se realizó mediante modelos BBD y ANN. La l-tirosina, la sacarosa y el intervalo de incubación fueron las variables independientes encontradas en la matriz BBD. Ambos modelos fueron eficientes en la determinación de las mejores condiciones para la máxima producción de melanina. Sin embargo, el paradigma de RNA mostró una superioridad en el proceso de optimización, arrojando 10,192 ± 0,782 g/L. ANN predijo con precisión la producción de melanina y mostró una mayor mejora en la producción de melanina en aproximadamente un 9,7% más que BBD. Curiosamente, la L-tirosina no tiene ningún efecto significativo durante el proceso de optimización de la melanina. Las características estructurales de la melanina producida se establecieron mediante análisis SEM, XRD, EDX y TGA. El análisis SEM mostró la agregación de partículas de melanina en pequeños compases. El análisis XRD especificó el espaciado entre capas en las hojas apiladas, y la falta de cristalinidad se considera una característica física confiable. El análisis EDX identificó el porcentaje atómico máximo para átomos de carbono y oxígeno en 65,40 y 30,04%, respectivamente. La descomposición de peptona en el TGA se registró con una tasa de pérdida de peso inducida del 33% a 191,55 °C. Es importante destacar que nuestros resultados son, por lo tanto, los primeros en optimizar la producción de melanina mediante el paradigma de inteligencia artificial en un medio simple utilizando el nuevo endofítico A pullulans AKW. El trabajo actual sugiere desarrollar nuevos métodos para la producción de melanina por A. pullulans AKW a mayor escala, permitiendo así su implicación en diferentes productos. Además, se podría realizar un trabajo de investigación para centrarse en el estado actual de la genética detrás de la producción de melanina microbiana, así como el potencial de la ingeniería genética para mejorar la producción de melanina microbiana (Información complementaria S1 y S2).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y en los archivos complementarios.

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Los autores extienden su agradecimiento al Proyecto de Apoyo a Investigadores número (RSP2023R114), Universidad Rey Saud, Riad, Arabia Saudita.

Unidad de Actividad Microbiana, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigación de Suelos, Agua y Medio Ambiente, Centro de Investigación Agrícola, Giza, 12619, Egipto

WesamEldin I. A. Saber, Abeer A. Ghoniem & Mohammed S. El-Hersh

Departamento de Botánica y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Rey Saud, 11451, Riad, Arabia Saudita

Fatimah O. Al-Otibi

Departamento de Patología de Semillas, Instituto de Investigación de Patología Vegetal, Centro de Investigación Agrícola, Giza, 12619, Egipto

Porque M. Eldadamony

Departamento de Ingeniería Biomédica y Ambiental (BEE), Fluorotronics, Inc. California Innovation Corporation, San Diego, CA, 92037, EE. UU.

Farid Menaa

Unidad de Ingeniería Genética y Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Mansoura, Calle El-Gomhoria, Mansoura, 35516, Egipto

Khaled Elattar

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Conceptualización, WIAS, AG, FA-O., FM y KE; curación de datos, ME-H., FM y KE; análisis formal, AG, ME-H., NE, FM y KE; investigación, AG, FA-O., NE y KE; metodología, WIAS, AG, NE y KE; administración de proyectos, FA-O.; recursos, FA-O.; software, WIAS; supervisión, WIAS, ME-H., NE y KE; validación, FA-O., ME-H., NE y FM; visualización, WIAS, AG y FM; redacción: revisión y edición, WIAS, AG, ME-H. y FM Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a WesamEldin IA Sabre, Fatimah O. Al-Otibi o Noha M. Eldadamony.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sabre, WIA, Ghoniem, AA, Al-Otibi, FO et al. Un estudio comparativo utilizando metodología de superficie de respuesta y red neuronal artificial para optimizar la producción de melanina por Aureobasidium pullulans AKW. Representante científico 13, 13545 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40549-z

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Recibido: 25 de mayo de 2023

Aceptado: 12 de agosto de 2023

Publicado: 19 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40549-z

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